如何進行全基因組數據CNV分析

如何進行全基因組數據CNV分析

引言

拷貝數變異（Copy Number Variation, CNV）是指基因組中某些區域的拷貝數發生增加或減少的現象。CNV在人類基因組中廣泛存在，并且與多種疾病、表型變異以及進化過程密切相關。隨著高通量測序技術的發展，全基因組測序（Whole Genome Sequencing, WGS）已成為研究CNV的重要工具。本文將詳細介紹如何進行全基因組數據CNV分析，包括數據預處理、CNV檢測、結果解讀和可視化等步驟。

數據預處理

1. 數據獲取

全基因組測序數據通常以FASTQ格式存儲，包含測序讀段（reads）的序列信息。在進行CNV分析之前，首先需要獲取這些原始數據。

2. 數據質量控制

數據質量控制是確保后續分析準確性的關鍵步驟。常用的工具包括FastQC和MultiQC，用于評估測序數據的質量，如讀段長度、堿基質量分布、GC含量等。

fastqc sample.fastq.gz
multiqc .

3. 數據比對

將測序讀段比對到參考基因組是CNV分析的基礎。常用的比對工具包括BWA、Bowtie2和STAR。比對結果通常以BAM格式存儲。

bwa mem reference.fa sample.fastq.gz > sample.sam
samtools view -bS sample.sam > sample.bam
samtools sort sample.bam -o sample.sorted.bam
samtools index sample.sorted.bam

4. 比對后處理

比對后處理包括去除重復讀段、局部重比對和堿基質量重校正等步驟。常用的工具包括Picard和GATK。

java -jar picard.jar MarkDuplicates I=sample.sorted.bam O=sample.dedup.bam M=sample.metrics.txt
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R reference.fa -I sample.dedup.bam -o sample.intervals
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R reference.fa -I sample.dedup.bam -targetIntervals sample.intervals -o sample.realigned.bam
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R reference.fa -I sample.realigned.bam -knownSites dbsnp.vcf -o sample.recal_data.table
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -R reference.fa -I sample.realigned.bam -BQSR sample.recal_data.table -o sample.recalibrated.bam

CNV檢測

1. 基于讀段深度的CNV檢測

基于讀段深度的CNV檢測方法通過統計基因組不同區域的讀段覆蓋深度來推斷CNV。常用的工具包括CNVnator、Control-FREEC和DELLY。

cnvnator -root sample.root -tree sample.recalibrated.bam
cnvnator -root sample.root -his 100 -d reference_dir
cnvnator -root sample.root -stat 100
cnvnator -root sample.root -partition 100
cnvnator -root sample.root -call 100 > sample.cnv.txt

2. 基于讀段對的CNV檢測

基于讀段對的CNV檢測方法通過分析讀段對的插入片段大小和方向來檢測CNV。常用的工具包括BreakDancer和Lumpy。

breakdancer-max -o sample.breakdancer.txt sample.recalibrated.bam
lumpyexpress -B sample.recalibrated.bam -o sample.lumpy.vcf

3. 基于組裝的方法

基于組裝的方法通過將測序讀段組裝成連續的序列，然后與參考基因組進行比較來檢測CNV。常用的工具包括SPAdes和Canu。

spades.py -o sample_assembly -1 sample_1.fastq.gz -2 sample_2.fastq.gz
canu -p sample -d sample_assembly genomeSize=3g -pacbio-raw sample.fastq.gz

結果解讀

1. CNV注釋

CNV注釋是將檢測到的CNV與已知的基因、功能元件和疾病關聯進行比對。常用的工具包括Annovar和VEP。

annovar/annotate_variation.pl -buildver hg19 -out sample -dbtype refGene sample.cnv.txt annovar/humandb/
vep -i sample.cnv.vcf -o sample.vep.vcf --cache --dir_cache /path/to/cache --species homo_sapiens

2. CNV功能分析

CNV功能分析旨在理解CNV對基因功能和表型的影響。常用的方法包括基因集富集分析（GSEA）和通路分析。

gsea-cli.sh GSEA -res sample.gct -cls sample.cls -gmx sample.gmx -out sample_gsea

3. CNV與疾病關聯分析

CNV與疾病關聯分析旨在識別與特定疾病相關的CNV。常用的方法包括病例-對照研究和全基因組關聯分析（GWAS）。

plink --bfile sample --cnv-list sample.cnv.txt --cnv-test --out sample_cnv_assoc

結果可視化

1. CNV圖譜

CNV圖譜是展示基因組中CNV分布的可視化工具。常用的工具包括Circos和IGV。

circos -conf circos.conf
igv.sh -g hg19 sample.bam sample.cnv.txt

2. CNV熱圖

CNV熱圖用于展示多個樣本中CNV的分布和頻率。常用的工具包括Heatmap.2和ComplexHeatmap。

library(ComplexHeatmap)
heatmap.2(cnv_matrix, scale="row", col=colorRampPalette(c("blue", "white", "red"))(100))

3. CNV網絡分析

CNV網絡分析用于展示CNV之間的相互作用和調控關系。常用的工具包括Cytoscape和Gephi。

cytoscape.sh -N sample.cnv.network

結論

全基因組數據CNV分析是一個復雜但強大的工具，能夠揭示基因組結構變異與表型、疾病之間的關聯。通過數據預處理、CNV檢測、結果解讀和可視化等步驟，研究人員可以深入理解CNV的功能和影響。隨著技術的不斷進步，CNV分析將在基因組學和精準醫學中發揮越來越重要的作用。

參考文獻

1. Alkan, C., Coe, B. P., & Eichler, E. E. (2011). Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics, 12(5), 363-376.
2. Mills, R. E., Walter, K., Stewart, C., Handsaker, R. E., Chen, K., Alkan, C., … & Eichler, E. E. (2011). Mapping copy number variation by population-scale genome sequencing. Nature, 470(7332), 59-65.
3. Sudmant, P. H., Rausch, T., Gardner, E. J., Handsaker, R. E., Abyzov, A., Huddleston, J., … & Eichler, E. E. (2015). An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature, 526(7571), 75-81.

以上是關于如何進行全基因組數據CNV分析的詳細步驟和方法。希望本文能為從事基因組學研究的科研人員提供有價值的參考。