如何使用conifer進行WES的CNV分析

如何使用Conifer進行WES的CNV分析

引言

全外顯子測序（Whole Exome Sequencing, WES）是一種廣泛應用于基因組學研究的技術，主要用于檢測編碼區域的變異。然而，除了單核苷酸變異（SNVs）和小插入/缺失（indels）之外，拷貝數變異（Copy Number Variations, CNVs）也是影響基因功能的重要因素。CNVs是指基因組中某些區域的拷貝數增加或減少，可能導致基因劑量效應，從而影響表型。

Conifer（Copy Number Inference From Exome Reads）是一種專門用于從WES數據中檢測CNV的工具。本文將詳細介紹如何使用Conifer進行WES數據的CNV分析。

1. 準備工作

1.1 軟件安裝

首先，確保你的系統上已經安裝了以下軟件：

• Python 2.7
• R
• SAMtools
• BEDTools

Conifer可以通過以下命令從GitHub上克隆并安裝：

git clone https://github.com/abyzovlab/Conifer.git
cd Conifer
python setup.py install

1.2 數據準備

你需要準備以下數據：

• WES測序數據的BAM文件
• 目標區域文件（BED格式）
• 參考基因組文件（FASTA格式）

2. 數據預處理

2.1 生成RPKM文件

Conifer使用RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）值來標準化測序深度。首先，你需要為每個樣本生成RPKM文件。

conifer rpkm --probes probes.txt --input sample.bam --output sample.rpkm.txt

其中，probes.txt是目標區域的BED文件，sample.bam是測序數據的BAM文件，sample.rpkm.txt是輸出的RPKM文件。

2.2 合并RPKM文件

如果你有多個樣本，需要將它們的RPKM文件合并成一個矩陣。

conifer merge --input sample1.rpkm.txt sample2.rpkm.txt --output all_samples.rpkm.txt

3. CNV檢測

3.1 運行Conifer分析

使用合并后的RPKM文件運行Conifer進行CNV檢測。

conifer analyze --probes probes.txt --rpkm all_samples.rpkm.txt --output analysis_results.hdf5

3.2 生成CNV調用

從分析結果中生成CNV調用。

conifer call --input analysis_results.hdf5 --output cnv_calls.txt

4. 結果解讀

4.1 CNV調用文件

cnv_calls.txt文件包含了檢測到的CNV區域及其拷貝數狀態。每一行代表一個CNV事件，包含以下信息：

• 樣本ID
• 染色體
• 起始位置
• 終止位置
• 拷貝數狀態（增益或缺失）

4.2 可視化

你可以使用R或其他可視化工具對CNV結果進行可視化。Conifer提供了一個R腳本來生成CNV圖譜。

library(Conifer)
cnv_data <- read.table("cnv_calls.txt", header=TRUE)
plotCNV(cnv_data)

5. 高級分析

5.1 過濾CNV調用

你可以根據CNV的大小、拷貝數狀態等條件對CNV調用進行過濾。

conifer filter --input cnv_calls.txt --output filtered_cnv_calls.txt --min_size 1000 --max_size 1000000

5.2 比較多個樣本

Conifer還支持比較多個樣本之間的CNV差異。

conifer compare --input cnv_calls.txt --output comparison_results.txt

6. 常見問題與解決方案

6.1 數據質量問題

如果RPKM值波動較大，可能是由于測序深度不均勻或目標區域覆蓋不均。建議檢查BAM文件的質量，并確保目標區域文件準確。

6.2 軟件兼容性問題

Conifer依賴于Python 2.7，如果你的系統上安裝了Python 3.x，可能需要使用虛擬環境來運行Conifer。

virtualenv -p /usr/bin/python2.7 conifer_env
source conifer_env/bin/activate

7. 結論

Conifer是一個強大的工具，能夠從WES數據中檢測CNV。通過本文的介紹，你應該能夠使用Conifer進行WES數據的CNV分析，并對結果進行解讀和可視化。希望本文對你有所幫助，祝你在基因組學研究中取得豐碩的成果！

參考文獻

1. Abyzov, A., Urban, A. E., Snyder, M., & Gerstein, M. (2011). CNVnator: an approach to discover, genotype, and characterize typical and atypical CNVs from family and population genome sequencing. Genome research, 21(6), 974-984.
2. Krumm, N., Sudmant, P. H., Ko, A., O’Roak, B. J., Malig, M., Coe, B. P., … & Eichler, E. E. (2012). Copy number variation detection and genotyping from exome sequence data. Genome research, 22(8), 1525-1532.

注意：本文假設讀者已經具備基本的生物信息學知識和命令行操作技能。如果你在操作過程中遇到問題，建議參考相關軟件的官方文檔或尋求專業人士的幫助。