如何進行limma對基因芯片數據基因差異表達分析

如何進行limma對基因芯片數據基因差異表達分析

引言

基因芯片技術是一種高通量的基因表達分析方法，能夠同時檢測成千上萬個基因的表達水平。通過對基因芯片數據的分析，研究人員可以識別在不同條件下（如疾病與健康、處理與對照）差異表達的基因，從而揭示潛在的生物學機制。limma（Linear Models for Microarray Data）是Bioconductor項目中的一個R包，專門用于分析基因芯片數據中的差異表達基因。本文將詳細介紹如何使用limma進行基因芯片數據的差異表達分析。

1. 準備工作

1.1 安裝和加載必要的R包

首先，確保你已經安裝了R和Bioconductor。然后，安裝并加載limma包。

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("limma")

library(limma)

1.2 數據導入

假設你已經有了基因芯片數據，通常以矩陣形式存儲，其中行代表基因，列代表樣本。數據可以從GEO（Gene Expression Omnibus）等公共數據庫下載，或者從實驗室的實驗中獲得。

# 假設數據存儲在expr_data矩陣中
expr_data <- read.table("expression_data.txt", header=TRUE, row.names=1)

2. 數據預處理

2.1 數據標準化

基因芯片數據通常需要進行標準化處理，以消除技術差異和批次效應。常用的標準化方法包括quantile normalization和RMA（Robust Multi-array Average）。

# 使用limma的normalizeBetweenArrays函數進行標準化
expr_data_normalized <- normalizeBetweenArrays(expr_data, method="quantile")

2.2 數據過濾

為了減少噪聲和提高分析的可靠性，通常需要對數據進行過濾，去除低表達或變化較小的基因。

# 過濾低表達基因，例如保留在所有樣本中表達量大于某個閾值的基因
expr_data_filtered <- expr_data_normalized[rowMeans(expr_data_normalized) > 5, ]

3. 構建設計矩陣

設計矩陣（design matrix）用于描述實驗設計，指定哪些樣本屬于哪些組別。例如，假設你有兩組樣本：對照組和實驗組。

# 假設前10個樣本是對照組，后10個樣本是實驗組
group <- factor(c(rep("Control", 10), rep("Treatment", 10)))
design <- model.matrix(~0 + group)
colnames(design) <- c("Control", "Treatment")

4. 擬合線性模型

使用limma的lmFit函數擬合線性模型，計算每個基因的表達水平與實驗條件之間的關系。

fit <- lmFit(expr_data_filtered, design)

5. 構建對比矩陣

對比矩陣（contrast matrix）用于指定感興趣的對比，例如實驗組與對照組之間的差異。

contrast_matrix <- makeContrasts(Treatment - Control, levels=design)

6. 計算差異表達

使用contrasts.fit函數計算差異表達，并使用eBayes函數進行經驗貝葉斯調整，以得到更穩定的結果。

fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast_matrix)
fit2 <- eBayes(fit2)

7. 提取差異表達基因

使用topTable函數提取差異表達基因的結果?？梢灾付@著性水平（如p值<0.05）和倍數變化（如|logFC|>1）來篩選顯著差異表達的基因。

results <- topTable(fit2, coef=1, number=Inf, p.value=0.05, lfc=1)

8. 結果可視化

8.1 火山圖

火山圖是一種常用的可視化方法，用于展示差異表達基因的顯著性（p值）和倍數變化（logFC）。

volcanoplot(fit2, coef=1, highlight=10)

8.2 熱圖

熱圖可以展示差異表達基因在不同樣本中的表達模式。

library(pheatmap)
pheatmap(expr_data_filtered[rownames(results), ], scale="row", clustering_distance_rows="euclidean", clustering_distance_cols="euclidean", clustering_method="complete")

9. 功能富集分析

為了進一步理解差異表達基因的生物學意義，可以進行功能富集分析，如GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析。

if (!requireNamespace("clusterProfiler", quietly = TRUE))
    BiocManager::install("clusterProfiler")

library(clusterProfiler)
# 假設差異表達基因的Entrez ID存儲在deg_entrez中
ego <- enrichGO(gene = deg_entrez, OrgDb = org.Hs.eg.db, ont = "BP", pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)

10. 結論

通過上述步驟，你可以使用limma包對基因芯片數據進行差異表達分析，識別在不同條件下顯著差異表達的基因，并通過功能富集分析進一步理解這些基因的生物學意義。limma的強大之處在于其靈活性和穩健性，能夠處理各種復雜的實驗設計和高通量數據。

參考文獻

1. Smyth, G. K. (2004). Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology, 3(1), Article 3.
2. Ritchie, M. E., Phipson, B., Wu, D., Hu, Y., Law, C. W., Shi, W., & Smyth, G. K. (2015). limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research, 43(7), e47.

通過本文的詳細步驟，你應該能夠熟練使用limma進行基因芯片數據的差異表達分析，并從中獲得有價值的生物學見解。